雙光子激發(fā)熒光(TPEF)顯微鏡，也稱為雙光子顯微鏡，是對活體組織深層三維成像的首選方法。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優(yōu)勢，它使用了更長的激發(fā)波長(通常是近紅外波段)，因而其帶來的散射比傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見波長更少。更長的波長同時也減少了來自散射光的背景照明，并增加了在更高深度處的對比度。目前，用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體內(nèi)大腦圖像。

在熒光顯微鏡中，當兩個獨立的光子被一種介質(zhì)同時吸收時，就會發(fā)生雙光子激發(fā)。這需要兩個合適能量的光子在這樣的介質(zhì)上時間和空間上同時重合;通常來說這不需要非常大的激發(fā)光子通量，當然光子通量越大， 雙光子同時被吸收的概率就越大。在TPEF顯微鏡中，更高的光子通量會帶來更高的效率，從而帶來圖像質(zhì)量和分辨率的提升。

在TPEF顯微鏡中，雙光子激發(fā)所需的大光子通量更多的是通過寬波段可調(diào)諧的鈦寶石飛秒激光器實現(xiàn)的，激光器典型規(guī)格脈寬為100fs，重復頻率約為80MHz，這可以給雙光子顯微鏡帶來非常高的峰值功率和大光子通量。然而，激光器較高的平均功率(在1~4瓦范圍內(nèi))會由于激發(fā)波長的線性吸收引起的與介質(zhì)的光熱相互作用而造成熱損傷。這種效應在體內(nèi)成像中尤其重要，因為溫度超過40oC會導致不可逆的損傷。因此，傳統(tǒng)的固態(tài)激光器所提供的平均功率必須被衰減才能實際應用于TPEF顯微鏡，峰值功率也會相應地降低。保持較低的平均功率以避免熱損傷，同時縮短脈沖持續(xù)時間是一種替代的提高峰值功率的方法。這減少了光子落在介質(zhì)上的時間間隔，同時提高了介質(zhì)被吸收的概率。

利用先進超連續(xù)譜全光纖激光器技術得到脈沖寬度短至15fs的商業(yè)激光器。與傳統(tǒng)的100fs激光器相比，SCH的15fs脈沖寬度可在相同平均功率水平下提供超過傳統(tǒng)飛秒激光器7倍的光子通量。

藍色線：飛秒激光器光譜曲線;

橙色線：1um波段百秒激光器光譜曲線;

灰色線：紅色熒光蛋白DsRed吸收截面光譜

但是，巨幅提高每個時間和面積上可用光子數(shù)量對圖像的真正影響是什么呢?

一、更高的激發(fā)效率，更高的圖像亮度

理論上，在雙光子顯微鏡中，圖像的亮度與激發(fā)效率直接相關，而激發(fā)效率完全依賴于光子通量和熒光團的二階非線性激發(fā)截面(GM) 。作為一個例子，我們可以嘗試計算熒光蛋白mRFP在15fs激光脈寬和1050nm中波長照射下的激發(fā)效率。與100fs的激光器相比，15fs激光器具有更寬的帶寬(達200nm)，可以在900到1200nm之間激發(fā)mRFP，與100fs激光器的11nm相比，這是一個更寬的光譜區(qū)域。

藍色曲線：以1050nm為中心的15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率;

橙色曲線：以1050nm為中心的100fs光纖飛秒激光器的峰值功率;

黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵截面(GM)

考慮到各波長的峰值功率和激發(fā)截面，可以計算出mRFP的激發(fā)效率。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)100fs激光器相比較，飛秒激光器15fs的脈沖寬度使得激發(fā)效率提高了50%。

二、多色同時激發(fā)

想象一下，同時成像多個波段范圍的熒光團，而不必考慮選擇最佳激發(fā)波長的激光器。在雙光子顯微鏡中，使用傳統(tǒng)的100fs激發(fā)激光器，這通常是一個復雜的，有時甚至是不可能完成的任務。傅里葉變換極限的100fs近紅外固體飛秒激光器(例如鈦寶石飛秒激光器、920nm光纖飛秒激光器)的光譜寬度通常在10~20nm范圍內(nèi)，它們只能同時激發(fā)激發(fā)光譜在10~20nm光譜范圍內(nèi)的熒光團。因此，若想用單臺激光器去同時激發(fā)更多種類的熒光團就需要帶寬更寬，脈沖更短的激光器。

飛秒激光器在提供15fs脈沖寬度的同時以1050nm為中心波長提供200nm的帶寬，在這個帶寬范圍內(nèi) (橫跨900到1200nm)的所有綠色和紅色的熒光團都可以同時被這種激光器激發(fā)。這對于雙光子顯微鏡來說，同時對多個熒光團成像成為一個可行的，實用的和簡單的替代。

常見熒光探針激發(fā)波長

綜上所述，光纖飛秒激光器激光器，提供15fs的脈沖持續(xù)時間和一流的高峰值功率(>200kW)，為體內(nèi)樣本的低光損傷激發(fā)提供了強大的工具。結(jié)合全光纖激光器的緊湊性和堅固性性，飛秒激光器成為雙光子顯微鏡的特殊激光選擇。